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聚丙烯酰胺凝胶电泳介绍

624 人阅读发布时间:2023-10-27 17:22

凝胶电泳是生物学科实验室中的一项基本技术,可以分离大分子,如DNA、RNA和蛋白质。聚丙烯酰胺凝胶,当蛋白质在电场力作用下移动通过凝胶时,凝胶的孔结构允许较小的蛋白质以更快的通过,较大的蛋白质则更慢通过。较大和较小蛋白质之间迁移速率的差异就导致了它们在凝胶中的物理分离。

1.PAGE的工作原理
PAGE是一种技术,根据蛋白质等大分子的电泳迁移率(即分析物向相反电荷的电极移动的能力)来分离它们。在PAGE中,这由分子的电荷、大小(分子量)和形状决定,分析物通过聚丙烯酰胺凝胶中形成的孔隙移动。
与DNA和RNA不同的是,蛋白质的电荷根据所加入的氨基酸而不同,这可能影响它们的运行方式。氨基酸串也可能形成二级结构,影响它们的表面大小,从而影响它们如何通过孔隙移动。因此,如果需要更准确地估计蛋白质的大小,有时最好在电泳前将其变性,使其线性化。

①PAGE和SDS-PAGE区别
a.PAGE:非变性凝胶电泳
PAGE不需要加入SDS或β-巯基乙醇。在PAGE中,蛋白质分子的迁移率取决于它所带的电荷以及分子大小。PAGE通常用于分离和检测非变性蛋白质。
b.SDS-PAGE:变性凝胶电泳
    在SDS-PAGE中,蛋白质样品会被加入十二烷基硫酸钠(SDS)和β-巯基乙醇,使其变性并带负电荷。 SDS-PAGE可以使蛋白质分子的迁移率与其分子量成正比,从而实现蛋白质分子的分离。

②电泳装置
电泳装置主要包括两个部分:电源和垂直电泳槽。
电源:提供恒定的电压或电流的输出用于电泳。
垂直电泳:1-4块胶同时运行,处理10-60个样品模块式设计,可与Mini TBM转印模块组成转印槽组装方便,防止漏液,兼容手工制胶与预制胶。

 
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③操作步骤
a.制备分离胶
首先将制胶的玻璃板紧密固定在制胶架上,避免漏液。根据需求配置相应浓度的分离胶,充分混匀后灌胶,再加入乙醇封胶。待胶凝固后,倒去上层的乙醇,并用吸水纸吸干。分离胶的高度一般位于梳子下1cm;温度越高,凝胶速度越快;通常凝胶过程约30min。
b.制备浓缩胶
按配方配置浓缩胶,充分混匀后灌胶,随后立即插入梳子。待胶凝固后,缓慢地拔出梳子。避免胶板内有气泡。
c.上样:微量移液器向凝胶孔中依次加入蛋白marker和样本,蛋白marker是已知蛋白条带分子量的预染蛋白,可作为标定蛋白大小的参考。
d.电泳:将凝胶和玻璃板浸入电泳缓冲液中后,就可以开始设定电压和时间,开始电泳了。
e.染色、脱色:电泳结束后,取出胶放入大培养皿中染色,使用考马斯亮蓝染液染色,然后加入脱色液,进行扩散脱色,直至蛋白质带清晰为止。
f.凝胶成像:当样品运行得足够远以获得足够的分离时,将凝胶从槽中取出并放在一个白光光箱上拍照。

 
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2.影响聚丙烯酰胺凝胶电泳因素
▶蛋白质大小、形状和电荷:在电场中,蛋白质向带相反电荷的电极移动。蛋白质具有各种大小和形状,并具有和其氨基酸组成相关的电荷。不同的蛋白质具有其特征性的迁移速率。
▶凝胶组成和强度:凝胶中的丙烯酰胺总量的百分比越高,孔径就越小,因此能够通过的蛋白质就越小。
▶缓冲液pH,离子类型和浓度:在水性介质中蛋白质的总电荷取决于其酸和碱的离子化程度,其总电荷可以通过缓冲液来控制。

 
                                                                                                                                                                                                                   
 
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