1.电泳的基本原理
电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团,它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
2.琼脂糖凝胶电泳
主要用于需要大孔分析直径大于10 nm的分子时。琼脂糖是从红海藻中提取的多糖。
琼脂糖凝胶电泳是一种电泳形式,用于根据核酸(DNA或RNA)片段的大小进行分离。当施加电流时,带负电的DNA/RNA通过琼脂糖凝胶的孔隙向凝胶带正电的一端迁移,较小的片段迁移较快。由此产生的条带可以用紫外线(UV)光来观察。
①电泳装置
电泳装置主要包括两个部分:电源和水平电泳槽。电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移。
②凝胶电泳原理
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。
③操作步骤
a.配胶:1%琼脂糖凝胶100ml:称取1.0 g琼脂糖置于锥形瓶中,加入100ml 1×TAE,微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液。
b.凝固:将制胶托盘和凝胶托盘洗干净晾干,待凝胶液冷却到60℃左右,倒在透明托盘上,并在固定位置放好梳子,等凝胶液完全凝固。垂直轻拔梳子,取下凝胶,将凝胶及内槽放入电泳槽中。
c.加样:用移液枪分别将样品加入凝胶孔中,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
d.电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,设置电压,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳。
e.凝胶成像观察:当样品运行得足够远以获得足够的分离时,将凝胶从槽中取出并放在一个紫外光箱上。然后,夹层染料可以使样品条带可视化,并通过与已知条带大小的DNA marker进行比较来确定其大小。
3.影响琼脂糖凝胶电泳因素
影响琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率因素:DNA的分子大小、琼脂糖浓度、DNA分子的构象、电源电压、嵌入染料的存在、离子强度影响等。
▶ DNA分子的大小:DNA 片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比。分子越大,摩擦阻力越大,同时大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子,所以分子大的迁移慢。等量的空间结构,紧密的电泳块(超螺旋>线性DNA)一般来说分子带的电荷量越大、直径越小,形态越接近球形,则其电泳迁移速度越快。
▶ 凝胶的浓度:浓度越大,分子孔径就越小,DNA迁移率就越低,反之迁移率就大,浓度也跟凝胶的分辨率有关,浓度越大,分辨率越高,但分离的DNA片段就越小。
▶ DNA的构象:一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。
▶ 电泳缓冲液:溶液PH值距离其等电点越远,其所带净电荷就越大,电泳速度也越大,尤其是对蛋白质等两性分子,缓冲液的PH值还会影响其电泳方向。溶液的离子强度过低,会使电导率降低,DNA不是全然不动就是迁移极慢;而离子过强时,电导率上升,会产生大量热能,使凝胶变化甚至熔化,也会使DNA变性。
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