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western blot相关产品介绍

596 人阅读发布时间:2023-11-14 15:00

Western Blot(WB)的中文名为蛋白质免疫印迹实验,是分子生物学中最常用的蛋白质检测技术。WB通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白样本按分子量大小进行分离,随后转移至固相载体上,经过抗体的免疫杂交和显色反应指示蛋白质的大小和含量,以评估细胞和组织中蛋白的表达情况。

一、原理
Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

二、实验流程
Western Blot实验流程: 

 
新闻图片1
 
1.样本制备和蛋白定量
提取方法根据检测目标的类型可分为总蛋白提取、核蛋白提取、膜蛋白提取,对于大多数应用进行总蛋白提取即可,样本如暂不进行后续实验需放在-80℃储存。使用蛋白定量地基和进行蛋白浓度测定。
总蛋白提取所需的试剂:裂解液、蛋白酶抑制剂。

 
实验流程品牌产品名称
样本制备Thermo/凯基/罗氏全蛋白提取试剂盒,RIPA裂解液,IP裂解液,
蛋白酶抑制剂Cocktail,磷酸酶抑制剂
蛋白定量Thermo/凯基Micro BCA 蛋白检测试剂盒,Pierce BCA 蛋白定量试剂盒,
BCA蛋白含量检测试剂盒,Bradford蛋白含量检测试剂盒

2.配胶
(1)制胶:上层浓缩胶(5%),下层分离胶(根据蛋白分子大小而定)
不同浓度SDS-PAGE分离胶范围:

 
SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围
6%胶50-150 kD
8%胶30-90 kD
10%胶20-80 kD
12%胶12-60 kD
15%胶10-40 kD
 

3.蛋白电泳
(1)配制上样体系:蛋白溶液,5×loading buffer,PBS。
(2)上样:通过对蛋白定量,在上样时候保证一个泳道的蛋白总量为30μg(根据具体情况而定,一般不超过30ug)。同时需要保证每一个泳道上样体积保持一致,可用loadding buffer补足(可上30ul)。
(3)电泳:盖上电源盖,正负极相互对应,接通电源,待 loading buffer中的溴酚蓝跑至脚底部1cm处停止电泳。

 
实验流程品牌产品名称
蛋白电泳凯基-预制胶12%预制胶,10%预制胶,SDS-PAGE彩色预混胶
凯基-PAGE凝胶制备SDS-PAGE凝胶配制试剂盒
凯基-蛋白Marker预染彩色蛋白分子量 Marker(11-250KD)
凯基6×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液
凯基10×Tris-甘氨酸蛋白电泳缓冲液
凯元-垂直电泳槽MP-8001 Mini P-4小型垂直电泳四块胶系统
凯元-电泳仪电源高电流电泳电源,高电压电泳电源,多用途电泳电源

4.转膜
(1)根据转膜机器的正负极,堆放各种样品:转膜板子:黑色一面(负极)→三层滤纸→SDS-PAGE胶→NC/PVDF膜(甲醇浸泡)→三层滤纸→红色一面(正极)→红色对应转膜槽的红色,黑色对应黑色。

 
实验流程品牌产品名称
转膜Thermo/凯基-转膜液Power Blotter 1-Step 转膜缓冲液 (5×)
10×电转移缓冲液
Pall/Millipore/罗氏-转印膜NC膜,PVDF膜
凯元超厚滤纸
凯元-垂直电泳转印槽MP-3030 Mini-TBC小型转移电泳槽

(2)膜的选择
膜通常是指孔径0.1-0.45μm的多孔材料,其结合能力主要取决于孔径大小。
①膜的选择

 
分子量膜的孔径
≤10kD0.1um
≤20kD0.2um
≥20kD0.45um

②NC膜和PVDF膜的区别
 
特性硝酸纤维素膜NCPVDF
蛋白结合能力80-110ug/cm2比NC膜强6倍125-200ug/cm2
背景相对NC膜有荧光背景
材质干的NC膜比较脆机械强度高
操作缓冲液浸润,无需甲醇激活提前用甲醇激活,目的是活化膜上的正电基团,
这样其就更容易与带负电荷的蛋白质结合
价格较低较高

5.封闭
配制5%脱脂牛奶,溶解于1×TBST中,室温封闭1h,或4℃过夜。

6.一抗孵育
配制抗体,稀释比例根据抗体说明书的要求,孵育。洗膜。

7.二抗孵育
配置抗体,稀释液为 1×TBST,比例需根据说明书要求大概为 1:3000~1:4000。孵育。洗膜。

8.显影
试剂盒A液+B液现配现用(A:B=1:1),避光保存,将膜放入暗盒中盛有显影液孵育5分钟,在孵育的过程中需要不停的摇晃暗盒,不要太剧烈。然后于仪器中拍照。

 
实验流程品牌产品名称
封闭凯基-封闭液WB封闭液
抗体孵育凯基内参抗体:β-actin,GAPDH
二抗:羊抗小鼠 IgG-HRP,羊抗兔 IgG-HRP
凯基WB一抗稀释液,WB二抗稀释液
达姆往复摇床
蛋白检测Thermo/凯基/勤翔ECL化学发光超敏显示试剂盒
勤翔ChemiScope 6000 Exp 化学发光成像系统

 
                                                                                                                                                                                                                   
 
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