Western Blot有这本指南就够了！

使用机械或化学方法提取生物样本中的蛋白质，定量总蛋白，样品与缓冲液混合，然后在凝胶上进行电泳。

蛋白样品被装载到凝胶上，通过电泳将它们按大小分开。

2. 灌注浓缩胶：倒掉覆盖在分离胶上的异丙醇或水，用滤纸吸干残留液体。接着配制浓缩胶，注入到分离胶上方，插入梳子，等待浓缩胶凝固，大约需要 30 分钟。 

3. 上样与电泳：将处理好的样本与 5× 上样缓冲液按 4:1 的比例混合，100℃煮沸 5 - 10 分钟使蛋白变性。将蛋白 Marker 和样本依次加入凝胶的加样孔中，注意不要产生气泡。连接电泳仪，先以 80V 的电压进行电泳，当样品进入分离胶后，将电压提高到 120 - 150V，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部，停止电泳，整个过程大约需要 1 - 2 小时。

将蛋白从凝胶基质移动到合成膜支持物上，并与膜相结合，形成印迹。

2. 组装转膜三明治：按照 “阳极板 - 滤纸 - PVDF 膜 - 凝胶 - 滤纸 - 阴极板” 的顺序组装转膜三明治，每一层之间都要用玻璃棒轻轻赶走气泡，确保紧密贴合，否则会影响转膜效率。 

3. 转膜：将组装好的转膜三明治放入转印仪中，设置合适的转膜条件。半干转印通常根据凝胶面积设置电流，一般为 0.8 - 1.2mA/cm²，转印时间 30 - 60 分钟；湿转印则根据蛋白分子量大小设置电压和时间，对于小分子蛋白（<50kDa），可以用 100V 转印 1 - 1.5 小时，大分子蛋白（>100kDa）可能需要 100V 转印 2 - 3 小时。

对转印后的膜进行封闭，阻断膜上未结合位点，以防止与抗体的非特异性结合。

膜首先与一种特异性针对目标蛋白上一个抗原表位的初级抗体孵育。经过几次洗涤后，随后会与一个标记的二级抗体孵育，以提供检测的手段。

将膜清洗以移除未结合的抗体后，使用二抗上的标签来可视化感兴趣的蛋白。抗体可以标记有产生颜色和光的酶，或者直接用荧光标记来可视化蛋白。