蛋白电泳常见问题及解决方法

01影响蛋白电泳迁移率的因素

●   电场强度——电场强度越大，蛋白质在凝胶中的迁移速度越快。这是因为在高强度的电场中，蛋白质移动速度会增加。

●   蛋白质性质——包括蛋白质的电荷数量、大小和形状。带电荷量越多的蛋白质在电场中的迁移速度越快。蛋白质的大小和形状也会影响迁移率，较小的蛋白质通常迁移得更快。

●   凝胶介质——凝胶的孔径大小和凝胶的离子浓度会影响蛋白质的迁移率。蛋白质在凝胶中的迁移过程中，会通过凝胶的孔径，而孔径的大小会限制蛋白质的迁移路径，从而影响迁移率。

●   缓冲液成分——电泳缓冲液的pH值和离子强度可以影响蛋白质的电荷状态，从而影响其迁移率。此外，缓冲液中的添加剂如SDS（十二烷基硫酸钠）可以影响蛋白质的结构，使其在凝胶中均匀带电，从而影响迁移率。

02 蛋白预制胶选择指南

根据样本类型、分离类型和分子量查找符合您研究需求的预制胶。

●   根据蛋白分子量选择预制胶浓度

对于分子量较小的靶标蛋白（如分子量＜25kDa，请使用较高浓度的分离胶进行电泳）。

对于分子量较大的靶标蛋白（如分子量＞100kDa，请使用较低浓度的分离胶进行电泳）。

●   选择合适的凝胶体系

●   选择凝胶尺寸和孔数

根据实验需求选择合适的尺寸（0.75mm、1.0mm、1.5mm）孔数（如10孔、15孔），以优化上样效率和实验通量。

03电泳常见问题分析

1. 关于凝胶的一些问题

1. 胶的凝结不好，凝胶不均匀。

解决方法:加大TEMED和过硫酸胺的量，使其凝结速度加快。同时洗干净玻璃板，防止有残留的胶干结在玻璃板上。过硫酸胺必须新鲜配制。如若还是不行重新配制一下缓冲溶液。建议电泳缓冲液不要回收利用。配制胶的溶液一定要纯。

2. 凝胶时间不对

通常胶在30分钟到1小时内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，AP剂量不够。如果凝的太快，可能是AP和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

3. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳的影响

前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的，一般对电泳结果不会有太大的影响。

4. 样品的处理

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

1.还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后，形成SDS与蛋白相结合的分子。

2.带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙-酸胺的烷基化作用可以很好的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙-酸胺可捕集过量的DT，而防止纹理现象的产生。100uL样品缓冲液中加入10uL20%的碘乙-酸胺，并在25℃下保藏30min。

3.非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

5. 条带两边翘起中间凹下的原因(︶)

在较厚的凝胶中，由于凝胶不均匀冷却，中间部分凝同不好。电泳系统温度偏高。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

6.条带两边向下中间鼓起的原因(⌒)

一般原因是两板之间的底部间隙气泡未排除干净，或聚合不完全。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

7.电泳的条带过粗

电泳中条带很粗主要是浓缩胶的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度，保证浓缩胶的PH正确，适当降低电压。

8.拖尾现象

主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理方法：加样前离心，选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂， 电泳缓冲液时间过长，重新配制，降低凝胶浓度。