实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
1.荧光定量PCR原理
实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)指的是在PCR进行的同时,对其过程进行监测的能力(即实时)。因此,数据可在PCR扩增过程中,而非PCR结束之后,进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中,反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征,而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高,则会越快观察到荧光的显著增加。相反,终点法检测(也称 “读板检测”)测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。
2.荧光定量PCR两种检测方法
①SYBR Green染料法:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
②水解探针法(TaqMan探针法):探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
| | 优点 | 缺点 |
| SYBR Green | 成本低 | 不能区分不同的双链DNA |
| 可以与任何PCR产物结合 | 不能区分不同的双链DNA |
| 兼容,使用方便 | 灵敏度低,适合5000拷贝以上的基因定量 |
| TaqMan探针 | 特异性高 | 成本高 |
| 荧光背景低 | 设计难度大 |
| 灵敏性高 | 只能用于检测产物长度低于150bp的反应 |
| 荧光光谱分辨率好 | |
3.罗氏LightCycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪
▲优势
三好一块:光源好 温控好 检测好 加热快
▲产品应用
用于基因表达分析研究,对目的基因的定量分析,进行SNP单核苷酸多态性和突变位点的分析检测。
▲产品特征
①温控好:温控系统
采用了Therma-Base高效热平衡专利技术,同时用了导热性能出色的银质材质,彻底解决边缘效应,孔间温度均一性达业内最佳,温度差异小于0.1℃
②光源好:光学元件
采用高强度白色固态光源。LightCycler 480 Ⅱ采用了精心设计的五角棱镜光学结构,光学元件及焦距的巧妙组合确保了整板型号激发的特异性与数据收集的一致性,从而消除边缘效应。LightCycler 96采用了2×96根独立光纤,每个孔对应2根光纤,一根用来传导激发光,另一根用来收集荧光信号,从而消除边缘效应。信号采集,采用冷CCD或CCD。
③检测系统好
冷CCD检测芯片保证优秀的分辨率和重复性。
④加热降温快
一小时内完成40个循环的常规检测。温度变化越快,PCR扩增产物的特异性越好。
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